厭氧氨氧化（anammox）介導(dǎo)的微生物脫氮具有成本效益，但在常規(guī)污水處理廠中累積緩慢生長的厭氧氨氧化菌十分費時。接種富含厭氧氨氧化微生物的污泥顆粒是快速建立復(fù)雜微生物氮轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)的有效方式。本文應(yīng)用宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法研究了3個代表部分硝化-厭氧氨氧化（PNA）和硝化-反硝化除氮工藝的污水處理廠接種外源anammox顆粒后的微生物脫氮效果。
結(jié)果表明，在不同的污水處理廠中，不同的活性組協(xié)同工作以實現(xiàn)有效的脫氮。證實了通過直接接種外源anammox污泥顆粒在富氨體系中應(yīng)用anammox的可行性，并從理化和組學(xué)兩個角度加深了人們對厭氧氨氧化驅(qū)動的污水處理脫氮過程中微生物氮循環(huán)的理解。
論文ID
原名：Complex microbial nitrogen-cycling networks in three distinct anammox-inoculated wastewater treatment systems
期刊：Water Research
IF：7.913
發(fā)表時間：2019年9月
通訊作者：顧繼東，李猛
通訊作者單位：香港大學(xué)生命科學(xué)院，深圳大學(xué)高等研究院
實驗設(shè)計
本文以臺灣新北市八里區(qū)（BL）和林口區(qū)（LK）及臺中文山（WS）三個不同工藝的污水處理廠接種外源氨氧化銨污泥顆粒處理為對象，采集了經(jīng)過5年穩(wěn)定運行后的活性污泥樣本并接種到改良的氨氧化微生物培養(yǎng)基中進(jìn)行分批培養(yǎng)，此外基于15NO3-同位素測定厭氧氨氧化和反硝化速率。對活性污泥樣本土壤進(jìn)行DNA及RNA提取，利用高通量測序技術(shù)對土壤微生物群落進(jìn)行宏基因組及宏轉(zhuǎn)錄組測序。通過對功能基因進(jìn)行注釋及定量其相對豐度來研究氮轉(zhuǎn)化過程與功能基因及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的相關(guān)信息，進(jìn)一步明確廢水處理系統(tǒng)中復(fù)雜的微生物氮轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)。
結(jié)果
1厭氧氨氧化污水處理體系的建立及其脫氮性能
BL和WS是處理垃圾滲濾液的富氨污水處理廠；LK是氨氮濃度相對較低的市政污水處理廠，分別測量三個處理廠的進(jìn)出水中銨、硝、BOD、COD等指標(biāo)，得到污水處理廠的基本脫氮能力。在接種厭氧氨氧化污泥顆粒六個月后，在曝氣池中形成了大的厭氧氨氧化顆粒并檢測到厭氧氨氧化細(xì)菌的存在�；�15NO3-同位素素測定厭氧氨氧化和反硝化速率，結(jié)果表明：厭氧氨氧化是BL中產(chǎn)生氮氣的主要過程，在BL中不能檢測到反硝化活性。相反，反硝化作用是LK和WS的主要氮氣生成過程，同時，在WS中可以檢測到厭氧氨氧化過程。此外，三種稀釋5倍的活性污泥樣品在三天內(nèi)均可以完全氧化1毫摩爾氨。經(jīng)過一天的培養(yǎng)（圖1b），在BL（近0.6mM）中積累了大量的亞硝酸鹽，這可能是由于AOB和NOB的豐度極不平衡造成的結(jié)果。
圖1 基于15NO3-同位素測定BL, LK, WS三個污水處理廠活性污泥的脫氮及氨氧化效率。
2 基因組重建
從BL、LK和WS收集的三個活性污泥樣本上進(jìn)行宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組測序，共產(chǎn)生了14.8億條序列和10.6億條序列，從頭組裝并進(jìn)行binning共得到905個MAGs，其中196個是完整性大于80%，污染度小于10%的近完整MAGs。大部分為細(xì)菌，只有四株為古菌，分屬奇古菌門和廣古菌門。
3 氮循環(huán)相關(guān)基因的豐度與轉(zhuǎn)錄本
氨的消耗過程包括硝化作用（amo、hao和nxr）、反硝化作用（narG、nirK&S、norB&Z和nos）、厭氧氨氧化（hzs、hao和nxr）和氨同化作用（glnA）。這些氮轉(zhuǎn)化過程相關(guān)的基因豐度和轉(zhuǎn)錄水平都很高。而氨的生產(chǎn)過程，包括固氮（nifH）、硝酸鹽異化還原成銨（nrf）和尿素分解（ure），相關(guān)基因水平相對較低。此外amo和hao基因的高度表達(dá)使得氨能夠快速的被氧化消耗掉，在BL和WS中，hzs, hao 和nxr高度表達(dá)，表明厭氧氨氧化菌在積極參與脫氮過程。相比另外兩個處理廠樣本，發(fā)現(xiàn)在WS中，更多的基因參與表達(dá)，這反映了更為多樣微生物參與到了氮素轉(zhuǎn)化和去除過程。氨氮濃度相對較低的LK市政污水處理廠中氮轉(zhuǎn)化相關(guān)的功能基因和轉(zhuǎn)錄水平均低于另外兩個富氨樣本。
圖2 氮轉(zhuǎn)化過程功能基因豐度及轉(zhuǎn)錄水平對比分析。
4 脫氮相關(guān)微生物及復(fù)雜的微生物氮轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)
硝化作用通過提供氮底物在脫氮過程中起著關(guān)鍵作用。在BL中，Nitrosomonas（BL36和BL56）是主要的氨氧化細(xì)菌（AOB），具有功能基因（amo和hao）較高的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。Nitrospira（BL254）是BL中特有的亞硝酸鹽氧化細(xì)菌（NOB），但未在其中檢測到nxr三個亞基的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在LK中，Nitrosomonas是優(yōu)勢AOB，但未檢測到典型NOB。值得注意的是，在WS中檢測到全程硝化菌Nitrospira （WS1 10, WS238）。反硝化是一個呼吸過程，在這個過程中硝酸鹽被逐步還原為氮氣，硝酸鹽還原酶（Nar）、亞硝酸鹽還原酶（nirK/S）、一氧化氮還原酶（Nor）和氧化亞氮還原酶（Nos）是關(guān)鍵的反硝化酶。
厭氧氨氧化菌MAGs僅從處理垃圾滲濾液的富氨污水處理廠BL和WS中回收，說明厭氧氨氧化菌對底物的選擇性很強。在BL中檢測到Ca. Brocadia （BL1）和Ca. Kuenenia （BL10），在WS中檢測到Ca. Brocadia （ws118），與之前研究一致，這些菌株均過量表達(dá)，hao和hzs，Ca. Brocadia是主要的厭氧氨氧化微生物。
圖3構(gòu)建微生物氮循環(huán)網(wǎng)絡(luò)（a）氮循環(huán)過程示意，線條的粗細(xì)代表基因轉(zhuǎn)錄水平，不同的顏色代表氮轉(zhuǎn)化不同過程。（b）圓圈的大小代表MAGs、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及功能基因轉(zhuǎn)錄本的豐度差異。
4 厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶和Hao-like蛋白
從BL和W3中得到三個厭氧氨氧化細(xì)菌MAGs（BL1、BL10和WS118），命名為“Ca Brocadia sp. BL1”、“Ca Kuenenia stuttgartiensis genome BL10”和“Ca. Brocadia sp.WS118”。在BL1中未發(fā)現(xiàn)形成亞硝酸鹽還原酶（nirS或nirK），但在WS118中發(fā)現(xiàn)了一個非常弱的nirS轉(zhuǎn)錄本。僅在兩株Ca Brocadia中發(fā)現(xiàn)了一個形成銨的硝酸鹽異化還原酶基因簇（nrf），但Nrf酶在anammox代謝中的作用尚不清楚。
圖4 三種厭氧氨氧化菌MAGs中潛在的氮轉(zhuǎn)化過程（a）氮轉(zhuǎn)化模型（b）功能基因的轉(zhuǎn)錄豐度。紅色條代表基因組豐度，深黃色條代表基因轉(zhuǎn)錄水平。
討論
香港大學(xué)顧繼東團(tuán)隊: 接種厭氧氨氧化污泥顆粒的三種廢水處理系統(tǒng)中的微生物氮轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)
本文應(yīng)用宏基因組學(xué)的方法研究了不同工藝的污水處理廠接種外源anammox顆粒后的微生物脫氮，通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和基于N-15的同位素標(biāo)記得到證實。結(jié)果表明在BL處理廠中，部分氨在氨氧化細(xì)菌Nitrosomonas的作用下被氧化，亞硝酸鹽和殘余的氨被厭氧氨氧化菌Ca. Brocadia和Ca. Kuenenia轉(zhuǎn)化為氮氣。在WS處理廠中，氨氧化古菌Thaumarchaeota高于氨氧化細(xì)菌Nitrosomonas。在LK富含有機(jī)碳的硝化反硝化污水系統(tǒng)中，全程硝化菌Nitrospira是主要的硝化微生物。在不同的污水處理廠中，不同的活性組協(xié)同工作以實現(xiàn)有效的脫氮。
評論
本研究通過宏基因組、轉(zhuǎn)錄組及N-15同位素標(biāo)記技術(shù)，明確了不同底物環(huán)境下，污水處理廠中氮轉(zhuǎn)化過程的微生物機(jī)制及其在脫氮過程中發(fā)揮的重要作用。這些結(jié)果可以為人為在富氨體系下接種厭氧氨氧化污泥顆粒，建立厭氧氨氧化過程以及實現(xiàn)短程脫氮提供思路，并增強對其潛在微生物機(jī)制的理解，對于指導(dǎo)污水處理生產(chǎn)有重要參考意義。
